Embedded Files
Uvod
Perfundovana mikrodesticka je matice bioreaktoru integrovanych v mikrodestickovem formatu. Podporuje dlouhodobou kultivaci trirozmernych tkani pod stalym prutokem a v mnoha dulezitych smerech napodobuje komplexni mikroprostredi jater.
Bioreaktory maji otevrene jamky, zabudovane pneumaticky aktivovane mikropumpy a perfuzni desticka ma zastrcny design, ktery usnadnuje manipulaci s destickami a jejich integraci s konvencnimi inkubatory a analytickymi pristroji. Pocet jamek na perfundovane desticce je mozne zvysit podobnym zpusobem jako u klasickych mikrodesticek (napriklad na 96 kusu). Vyssi pocet jamek v perfundovane desticce je dulezity pro toxigologicky a metabolicky vyzkum. Perfundovana desticka ma pouziti jako model hepatickych poruch, rakoviny a dalsich nemoci. I kdyz byla vyvinuta predevsim pro kultivaci jaternich bunek, muze byt pouzita pro pefundovanou kultivaci dalsich vysoce metabolicky aktivnich bunek jako jsou ledvinove, srdecni nebo mozkove bunky. Vice informaci o perfundovane desticce je mozne nalezt v nasledujicim clanku. [pdf]
Klasicke mikrodesticky
• bunky jsou kultivovany jako monovrstvy za statickych podminek
Fotografie: Karel Domansky
Perfundovane mikrodesticky
• bunky jsou kultivovany v mikrokanalcich, kde se samousporadaji do trirozmernych tkanovych jednotek
• trirozmerne tkane v mikrokanalcich jsou perfundovany vyzivnym roztokem
Design perfundovanych microdesticek
Perfundovana microdesticka je matice 12 otevrenych jamek. Kazda z nich se sklada reaktorove jamky, reservoarove jamky a zabudovane mirkopumpy. Reaktorova jamka obsahuje nosic bunek priblizne s 800 mikrokanalku. Steny mikrokanalku jsou pokryty extracelularnimi proteiny, ke kterym se bunky prichyti a samousporadaji se do miniaturnich tkani. Kazda jamka ma kapacitu 400 az 600 tisic bunek. Reservoarova jamka obsahuje kultivacni roztok, ktery je vestavenou membranovou mikropumpou kontinualne cirkulovan mezi reaktorovou a reservoarovou jamkou a skrz nosic bunek. Podobne jako u bezne pouzivanych plastovych mikrodesticek jsou jednotlive jamky bioreaktoru v perfundovane mikrodesticce od sebe fluidicky izolovane a prikryte jednim krytem. Toto usporadani zjednodusuje pridavani kultivacniho media do jednotlivych jamek a jeho odber.
Design: Karel Domansky a Walker Inman. Fotografie: Karel Domansky
Vyvysene okraje kolem cele mikrodesticky a kolem jednotlivych bioreaktoru snizuji moznost vzdusne kontaminace. Design otevrenych jamek napomaha manualnimu a robotickemu vysevu bunek a manipulaci s kultivacnim roztokem. Vzdalenost stredu jamek (18 mm) umoznuje pouziti vicekanalovych pipet (se spickami objedno).
Poznamka: Perfundovana mikrodesticka je vyfocena bez krytu. Fotografie: Karel Domansky
Mikropumpy jsou aktivovany vsechny najednou z pneumatickych vstupu, ktere jsou k mikrodesticce pripojeny pres dok. Pro tkanovou kultivaci jsou doky instalovany na policich v beznych CO2 inkubatorech a pro vysev bunek ve sterilnich boxech s laminarnim proudenim vzduchu. Pneumaticke hadicky spojuji dok s malym elektronickym ovladacem umistenym mimo sterilni prostredi. Perfundovane mikrodesticky neobsahuji zadnou elektroniku. Dokovy design perfundovanych desticek ma za nasledek to, ze manipulace s perfundovanymi destickami je podobna manipulaci s beznymi mikrodestickami.
Poznamka: Z ilustracnich duvodu neni na fotografii perfundovana mikrodesticka do doku zcela zastrcena. Fotografie: Karel Domansky
Perfundace tkani
Perfundace (promyvani) tkani v nosicich bunek kultivacnim mediem je docilene membranovymi mikropumpami, ktere jsou zabudovany v perfundovane mikrodesticce. Mikropumpy jsou aktivovany pneumaticky. Casovani pneumatickych signalu a tim padem velikosti prutoku kultivacniho roztoku skrz tkan je nastavene elektropneumatickym ovladacem. Ovladac obsahuje elektronicke obvody a elektromagneticke ventily. Pneumaticke signaly jsou prenasene z ovladace pres dok do perfundovane mikrodesticky pomoci tri pneumatickych hadicek. V perfundovane desticce jsou pak pneumaticke signaly dale paralelne rozvedeny ke vsem mikropumpam. Vyhodou pneumatickeho ovladani je to, ze ridici elektropneumaticke spinace s eletronikou mohou byt umisteny mimo inkubator a spojene s perfundovanou mikrodestickou uvnitr inkubatoru pomoci tri hadicek (viz zelene, zlute a oranzove hadicky na fotografii dole).
Poznamka: Perfundova mikrodesticka je prikryta krytem z polystyrenu, ktery postytuje ochranu pred vzdusnym znecistenim. Design: Karel Domansky a Walker Inman. Fotografie: Karel Domansky
Nosice pro prichyceni bunek a vytvoreni tkane
Nosic poskytuje trirozmernou fyzickou podporu pro uchyceni bunek a vytvoreni miniaturnich kousku tkane. Hlavni faktory, ktere se berou v potaz pri volbe rozmeru nosicu zahrnuji pozadavky tkanove morfologie a prenosu kysliku v kultivacnim mediu. Pri vyrobe nosicu je mozne pouzit siroke skaly materialu a vyrobnich postupu od mekkych materialu jako je hydrogel az po tvrde amorfni materialy jako je polystyren. Na fotografii dole jsou zachyceny polystyrenovy nosic vyrobeny mikromechanickym vrtanim a kremikovy nosic vyrobeny hlubokym leptanim pomoci reaktivnich iontu. Za ucelem zvyseni prichyceni bunek se nosice vetsinou pokryji vrstvou extracelularniho proteinu kolagenu.
Fotografie: Karel Domansky
Nosic bunec je zespodu zajisteny filtrem s podperou. Funkce filtru je zachytit bunky v nosici pri vysevu bunek. Reservoar rovnez obsahuje filtr, ktery zabranuje neprichycenym bunkam proniknout do mikropump a ventilu.
Druhy bunek kultivovane v perfundovane mikrodestice
Krysi a lidske hepatocyty
Kremikovy nosic byl vyrobeny hlubokym leptanim pomoci reaktivnich iontu.
Fotografie: Sharon Karackattu
Mysi hepatocyty (den 7)
Polystyrenovy nosic bunek s vrtanymi kanalky o prumeru 340 µm. Fotografie: Karel Domansky
3D model perfundovanych mikrodesticek
Mikropumpy, mikroventily a fluidicke kondenzatory byly vyrobeny vlozenim tenke (~25 µm) polyuretanove membrany s velkou pruznosti mezi horni (fluidickou) desticku a spodni (pneumatickou) desticku. Tato membrana rovnez vytvari barieru mezi sterilni horni destickou (obsahujici tkanove kultury) a nesterilni spodni destickou (obsahujici pneumaticke system). Geometricke serizeni horni a spodni desticky je zajistene pomoci montaznich koliku. Dve pruzne silikonove membrany na predni strane spodni desticky se pohybuji ve fazi s polyuretanovou membranou ve ventilech a mikropumpach a indikuji radnou cinnost cirkulacniho systemu.
Design: Karel Domansky a Walker Inman
3D model: Karel Domansky
Rozlozeny pohled jednotlivych soucastek v reaktorove jamce
Mikropumpy, mikroventily a fludicke kondenzatory
Kazda reaktorova jamka obsahuje jeden tesnici krouzek, podperu nosice, filtr a nosic bunek, ktere jsou stlaceny a zajisteny upevnovacim krouzkem. Kazda reservoarova jamka obsahuje jeden filtr zajisteny upevnovacim krouzkem (podpera filtru je zabudovana do dna jamky). Kapsicky na stranach jamek slouzi k vyjmuti upevnovacich krouzku a ostatnich soucastek pomoci pinzety.
Prazdny bioreaktor (horni obrazek) a bioreaktor osazeny soucastkami (spodni obrazek).
Perfundace tkani vyzivnym mediem je provedena pneumatickymi mikropumpami zabudovanymi v mikrodestice. Okamzite po vyseti bunek jsou mikropumpy naprogramovany tak, aby cirkulovaly kultivacni roztok smerem dolu skrz nosic s bunkami (smer 2). Po tom, az se bunky prichyti k nosici (4 - 8 hodin), je smer cirkulace obracen (smer 1), aby se odstranil bunecny odpad z filtru. Tento smer cirkulace se pak pouziva po celou dobu kultivace tkani.
Prurez bioreaktorem osazeneho soucastkami.
Mikropumpy maji cerpaci komoru lasturoveho tvaru a dva aktivni ventily. Profilovy tvar cerpaci komory v kombinaci s tenkou membranou snizuje pozadavky na pouzity tlak vzduchu a zajistuje staly zdvihovy objem cerpaci komory. Relativne vysoky zdvihovy objem cerpaci komory ma za nasledek vysoky pomer stlaceni a zajistuje to, ze mikropumpa je samonasavaci a dokaze tolerovat vzduchove bublinky.
fluidicka strana
pneumaticka strana
3D model: Karel Domansky
Schematicky prurez a fotografie dvou ventilu a jedne cerpaci komory ilustrujici sest fazi cerpaciho cyklu.
Fotografie: Karel Domansky a Walker Inman
Fluidicky kondenzator je pouzit k premene pulzujiciho toku na vystupu z mikropumpy ke kontinualnimu toku vyzivneho roztoku skrz tkan v nosici bunek. Timto zpusobem fluidicky kondenzator odstranuje rozrusujici oscilacni pohyb bunek v mikrokanalcich nosice, ktery by zabranil prichyceni bunek k bocnim stenam mikrokanalku nosice.
Cerpany objem vyneseny jako funkce casu behem jednoho cerpaciho cyklu.
Funkce fluidickeho kondenzatoru je demonstrovana zobrazenim toku v kapilare. Zobrazeni bylo provedeno v milisekundovych intervalech pomoci specialni videokamery (casove lupy) Phantom V7.1 od firmy Vision Research. Horni video ukazuje tok v kapilare, ktera byla pripojena primo k vystupu membranove mikropumpy vytvarejici oscilujici tok. Po pripojeni fluidickeho kondenzatoru mezi mikropumpu a kapilaru je videt, jakym vyraznym zpusobem fluidicky kondenzator dokaze odstranit tokove oscilace (spodni video) a vytvorit kontinualni tok.
Video: Karel Domansky a Walker Inman
S vice podrobnostmi o mikropumpe, ventilech a fluidickem kondenzatoru je mozne se seznamit v nasledujicim clanku. [pdf]
Inkubator
Behem kultivace bunek jsou perfundovane mikrodesticky zastrcene v docich upevnenych na policich inkubatoru. Pneumaticke hadicky spojuji dok s elektromagnetickymi ventily. Spinani ventilu a tim padem ovladani prutoku vyzivneho roztoku skrz tkan je programovano elektronickym ovladacem na dvirkach inkubatoru.
Poznamka: Z ilustracniho duvodu je na fotografii inkubatoru superponovana fotografie doku uvnitr inkubatoru. Vlozena fotografie znazornuje elektronicky ovladac, kterym se programuje spinani elektromagnetickych ventilu. Fen na vlasy na stolku mikroskopu je pouzit k odmlzeni krytu perfundovane mikrodesticky. Fotografie: Karel Domansky
Dalsi informace:
1) Navod k pouziti perfundovanych mikrodesticek. [pdf]
Page updated
Report abuse