Embedded Files
Uvod
"Viditelna jatra" - je mikrofluidicke zarizeni (mikroreaktor) pro dlouhodobou kultivaci trirozmernych jaternich tkani. Jaterni bunky se po vyseti do mikrokanalku nosice bunek samosestavi a vytvori matici trirozmernych jaternich tkani, napodobujich v urcitych smerech mikroprostredi jater. Tkan je behem perfundace kultivacnim roztokem zobrazena konfokalnim nebo dvoufotonovym mikroskopem s vysokou rozlisovaci schopnosti. Vzhledem k tomu, ze je tkan zkoumana prevazne optickymi metodami, zarizeni obsahuje relativne nizky pocet bunek (20 az 50 tisic). "Viditelna jatra" je mozne pouzit jako in vitro model pri zkoumani pocatecnich rustu jaternich rakovinovych nadoru, coz je velmi tezke udelat in vivo. Dalsi aplikaci je analyza barier pri doruceni genu v trirozmernych tkani. Vice informaci o jaternim mikroreaktoru je mozne nalezt v nasleduji knizni kapitole. [pdf]
Design Mikroreaktoru
Jednim z hlavnich funkcnich kriterii mikroreaktoru je dostupnost kultivovanych 3D tkani pro in situ mikroskopicke zobrazeni. Aby byl tento pozadavek splnen a bylo umozneno pouziti objektivu s vysokou numerickou aperturou, ma mikroreaktor velmi tenke (125 µm) polykarbonatove opticke okenko. Dale byl mikroreaktor navrzen takovym zpusobem, ze vzdalenost od vnejsi strany optickeho okenka ke tkani je pouhych 750 µm (vcetne tloustky sloupce kultivacniho roztoku nad tkani). Z horni plochy mikroreaktoru rovnez nic nevycniva, coz umoznuje skenovani objektivy s velmi nizkou pracovni vzdalenosti. Z tohoto duvodu byly pouzity miniaturni vstupni a vystupni fluidicke konektory umistene na bocni strane mikroreaktoru. Tento design vyzadal pouziti specialni vyrobni technologie.
Design, 3D Model & Fotografie: Karel Domansky
Hlavni casti mikroreaktoru "viditelna jatra" bylo vyrobeny mikroobrabenim a tepelne-difuznim spojovanim z polykarbonatu. Technologie byla vyvinuta autorem na MIT a prevedena do americke firmy Eastern Plastics, Inc. (nyni vlastnena firmou IDEX Corp.), kde pak byly touto technologii vyrobeny hlavni casti mikroreaktoru. [vice informaci]
System na perfundovani (promyvani) tkane
Mikroreaktor je propojeny hadickami s vysokou plynovou produsnosti se dvema externimi peristaltickymi pumpami, ktere cirkuluji kultivacni roztok mezi reservoarem a mikroreaktorem.
Fotografie: Karel Domansky
Nosice pro prichyceni bunek a samosestaveni tkane
Nosic poskytuje trirozmernou fyzickou podporu pro uchyceni bunek a vytvoreni tkane. Hlavni faktory, ktere se berou v potaz pri volbe rozmeru nosice bunek, zahrnuji pozadavky tkanove morfologie a prenos kysliku v kultivacnim mediu. Pri vyrobe nosicu je mozne pouzit siroke skaly materialu a vyrobnich postupu. Na horni fotografii je kremikovy nosic vyrobeny hlubokym leptanim pomoci reaktivnich iontu. Na fotografii dole je nosic z polyetylenu tereftalatoveho vyrobeny laserovym obrabenim. Za ucelem zvyseni ucinnosti prichyceni bunek se nosice vetsinou pokryji vrstvou extracelularniho proteinu kolagenu.
SEM images courtesy of JP Sercel Associates.
Mikroreaktor jako model pro zkoumani doruceni genu do trirozmernych tkani
Pote, co je jaterni tkan transfektovana adenovirusem s potlacenou schopnosti replikace, ktery je nosicem genu pro EGFP (rizeneho CMV promotorem), dvoufotonova mikroskopie poskytuje in situ trirozmerne prostorove informace o expresi genu. Trirozmerne zobrazovani je provedeno akvizici stohu obrazu v ruznych rovinach, kde kazda rovina koresponduje s urcitou hloubkou (ve smeru z) uvnitr mikrokanalku nosice bunek. Mrtve bunky jsou zbarvene cervene s Ethidium Homodimer; jadra vsech bunek jsou zbarvena modre s Hoechst (informace o celkovem poctu bunek v mikrokanalcich nosice); bunky expresujici EGFP jsou zelene. Na zaklade zobrazeni sedmi mikrokanalku ve dvou mikroreaktorech 60 hodin po zapocati transfekce byla ucinnost doruceni genu 45% a viabilita bunek 84%. Vice informaci o zkoumani doruceni genu do trirozmernych tkani v mikroreaktorech je mozne najit v nasledujicim clanku. [pdf]
Poznamka: Obrazy tkane v jednom kanalku o rozmerech 300 x 300 x 230 µm (kremikovy nosic).
Fotografie: Artemis Kalezi
Usporadani pro dvoufotonovou mikroskopii
Znacny pocet biologickych studii vyzaduje mikroskopicke studie, ktere trvaji od nekolika minut az do nekolika hodin. Dlouhodobe zobrazovani muze kompromitovat integritu zivych biologickych vzorku pokud teplota a pH nejsou patricne kontrolovany. Aby se udrzovaly fyziologicke podminky, primarni akrylova budka (inkubator) kolem mikroskopu (fotografie vlevo dole) poskytuje teplotni kontrolu vzorku behem dvoufotonoveho zobrazovani. Sekundarni pouzdro uvnitr akrylove budky (fotografie vpravo dole) obsahuje mikroreaktor (vlozena fotografie se spodnim pohledem) a poskytuje kontrolu pH. Z duvodu vysoke metabolicke aktivity jaternich bunek musi byt mikroreaktory perfundovany (promyvany) kultivacnim roztokem behem zobrazovani. Aby bylo zajistene perfundovani, sekundarni pouzdro rovnez obsahuje reservoar s vyzivnym roztokem a peristalticke pumpy.
Fotografie: Karel Domansky
Fluorescencni spektrometrie jaterni tkane kultivovane v mikroreaktoru
Tkan kultivovana uvnitr mikroreaktoru "viditelna jatra" muze byt opticky zkoumana pomoci fluorescencni spektrometrie. Na rozdil od vyse zminene konfokalni nebo dvoufotonove mikroskopie, jejiz cilem je poskytnuti detailni informace z maleho kousku tkane uvnitr jednoho mikrokanalku, fluorescencni spektrometricky system znazorneny na fotografie dole integruje fotony emitovane ze vsech mikrokanalku. Toto mereni ma schopnost podat rychle informace o stadiu transfekce a podat napriklad referencni casovy bod pro provedeni detailniho dvoufotonoveho zobrazeni. Vice informaci je mozne najit v nasleduji knizni kapitole. [pdf]
Design & Fotografie: Karel Domansky
Fluorescencni emisni spektrum EGFP po pridani AdEGFP (horni graf)
Fluorescencni intezita jako funkce casu po pridani AdEGFP (spodni graf)
Ve spolupraci s Artemis Kalezi.
Teplotu, pH, a velikost promyvaciho prutoku je mozne behem spektrometrickeho mereni kontrolovat pomoci zarizeni zobrazeneho na fotografii dole.
Design & Fotografie: Karel Domansky
Page updated
Report abuse