Embedded Files
Introduction
Kyslik je jednim z hlavnich regulatoru preziti bunek a jejich funkce. Z tohoto duvodu je nezbytne jeho koncentraci v kultivacnim roztoku adekvatne kontrolovat.
Behem provozu bioreaktoru cirkuluje kultivacni roztok mezi reaktorovou a reservoarovou jamkou. Kyslik je spotrebovan bunkami a doplnen difuzivnim tokem z rozhrani mezi kapalinou a vzduchem.
Koncentraci rozpusteneho kysliku na vstupu a vystupu nosice s bunkami je mozne merit pomoci kyslikovych sond, jako jsou napriklad opticke kyslikove sondy. Protoze je technicky velmi obtizne merit koncentraci rozpusteneho kysliku pod nosicem bunek, je tato koncentrace misto toho merena v reservoarove jamce. Toto je mozne udelat, protoze prenos kysliku skrz polyuretanovou membranu s nizkou prodysnosti je zanedbatelne nizky. Z duvodu pritomnosti gradientu koncentrace rozpusteneho kysliku v reservoarove jamce je nutne polohu kyslikove sondy v reservoarove jamce peclive zvazit.
Kyslikove sondy
Kyslik je detekovan pomoci sond z polymerovych optickych vlaken o prumeru 2 mm, ktere jsou na konci opatreny snimaci vrstvou z rutenioveho komplexu (Presens, Germany - www.presens.de). Princip detekce kysliku je zalozeny na tom, ze luminiscence ruteniovych molekul v excitovanem stavu je tlumena kolizemi s molekularnim kyslikem (quenching). Princip fazove modulace je pouzit pri vyhodnoceni casu dosvitu. Sondy se vyznacuji velni nizkym driftem po dobu nekolika dnu. Z tohoto duvodu jsou vhodne pro dlouhodoba mereni rozpusteneho kysliku v systemech pro kultivaci tkani.
Detailni fotografie opticke sondy vyrobene na zakazku zobrazuje ruteniovou snimaci vrstvu prilepenou na konci vlakna.
Fotografie: Karel Domansky
Pro upevneni a pripojeni je opticka sonda vybavena konektorem a spojkou.
Fotografie: Karel Domansky
Specialni kryt s kyslikovymi sondami
Kryt perfundovane mikrodesticky pro mereni rozpusteneho kysliku obsahuje 24 otvoru, ktere jsou umisteny ve stredovych osach jamek. Kazdy otvor je vybaveny konektorem a tesnicim krouzkem pro vertikalni upevneni sond. Sondy jsou ponoreny do kultivacniho roztoku tak hluboko, ze snimaci vrsvy na koncich vlaken jsou v tesne blizkosti nosicu bunek v reaktorove jamce a filtru v reservoarove jamce. Opticka vlakna vychazi z krytu kolmu nahoru a jsou dodatecne upevnena v horni casti krytu zhruba 10 cm od hlavniho krytu. Horni kryt obsahuje spojky pro pripojeni sond k optickym vlaknum vychazejicim z mericiho pristroje OXY-4 (Presens, Nemecko). Toto usporadani umoznuje nastaveni hloubky sond a rychle spojeni mezi sondami a optickymi vlakny.
Fotografie: Karel Domansky
Opticka vlakna s ruteniovych komplexem vycnivaji potrebnou vzdalenost nad vnitrni plochou krytu. Tato vzdalenost urcuje hloubku ponoru sond v kultivacnim roztoku.
Fotografie: Karel Domansky
Merici usporadani
Perfundovane mikrodesticky s vysetymi bunkami jsou umisteny do inkubatoru. Kyslikove sondy jsou spojene pomoci optickych vlaken s ctyrkanalovym mericim pristrojem OXY-4 (PreSens, Nemecko). Ctyrkanalovy pristroj umoznuje soucasne merit napriklad vstupni a vystupni koncentraci rozpusteneho kysliku ve dvou bioreaktorech (napr. merenem a kontrolnim) a spocitat miru spotreby kysliku. Technicke udaje o mericim pristroji je mozne vyhledat zde.
Fotografie: Karel Domansky
Z grafu dole je videt, ze vstupni koncentrace rozpusteneho kysliku se pohybuje kolem ~145 µM. Ackoliv je tato hodnota ponekud vyssi nez publikovane periportalni (sinusoidalni vstupni) hodnoty v lidskych jatrech (84–91 µM), je stale v mezich arterialnich koncentraci (104–146 µM) a nedosahuje hyperoxickych koncentraci. Dale je mozne z grafu videt, ze se koncentrace rozpusteneho kysliku na vystupu tkane zvysuje s narustajicim tokem (od ~19 µM do ~125 µM). Perivenousni (sinusoidalni vystupni) hodnoty pro lidska jatra se vetsinou uvadi kolem 42–49 µM. Vzhedem k tomu, ze vystupni tkanova koncentrace rozpusteneho kysliku se pohybuje kolem 50 µM pri prutoku kultivacniho media 0.25 mL/ min, da se usoudit, ze tento prutok poskytuje vhodny fyziologicky gradient koncentrace kysliku. Gradient je strmejsi nez in vivo protoze kultivacni roztok neobsahuje hemoglobin, ktery funguje jako zasobnik kysliku.
Vice informaci o mereni koncentrace rozpusteneho kysliku v bioreaktorech je mozne ziskat v nasledujim clanku. [pdf]
Poznamka: Okamzite po vysevu bunek je prutok o hodnote 0.25 mL/min naprogramovan smerem dolu skrz nosic s bunkami. Po 8 hodinach je smer cirkulace zmenen, aby se z nosice uvolnil bunecny odpad. Tento smer cirkulace je pak udrzovan behem zbyvajici casu kultivace tkane.
Page updated
Report abuse